خەۋەر

IPTG.IPTG نىڭ كىرگۈزۈلۈشى ئاستىدا ، ئىندۇكسىيە رېئاكتور ئاقسىلى بىلەن مۇرەككەپ شەكىل ھاسىل قىلالايدۇ ، شۇنداق قىلىپ بېسىم ئاقسىلىنىڭ ئۆزگىرىشى ئۆزگىرىدۇ ، شۇڭا ئۇنى نىشانلىق گېن بىلەن بىرلەشتۈرگىلى بولمايدۇ ھەمدە نىشان گېنى ئۈنۈملۈك ئىپادىلىنىدۇ.ئۇنداقتا تەجرىبە جەريانىدا IPTG نىڭ قويۇقلۇقىنى قانداق بېكىتىش كېرەك؟قانچە چوڭ بولسا شۇنچە ياخشىمۇ؟
ئالدى بىلەن ، IPTG كىرگۈزۈش پرىنسىپىنى چۈشىنىپ ئۆتەيلى: E. coli نىڭ لاكتوزا ئوپېراتسىيىسى (ئېلېمېنتى) Z ، Y ۋە A دىن ئىبارەت ئۈچ خىل قۇرۇلما گېنىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، بۇلار ئايرىم-ئايرىم ھالدا gal- گالاكتوسىدىزا ، ئۆتكۈزگۈچ ۋە ئاتسېتىلترانسفېرانى كودلايدۇ.lacZ گىدرولىز گلۇكوزا ۋە گالاكتوزا ياكى ئاللو-لاكتوزاغا كىرىدۇ.lacY مۇھىتتىكى لاكتوزانىڭ ھۈجەيرە پەردىسىدىن ئۆتۈپ ھۈجەيرىگە كىرىشىگە يول قويىدۇ.lacA ئاتسېتىل گۇرۇپپىسىنى ئاتسېتىل- CoA دىن gal- گالاكتوسىدقا يۆتكەيدۇ ، بۇ زەھەرلىك تەسىرىنى يوقىتىشنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.بۇنىڭدىن باشقا ، مەشغۇلات تەرتىپى O ، باشلىنىش تەرتىپى P ۋە تەڭشەش گېنى بار. I گېن كودى بېسىملىق ئاقسىل بولۇپ ، مەشغۇلات تەرتىپىنىڭ O ئورنىغا باغلىنالايدۇ ، شۇڭا ئوپېرون (مېتا) بېسىلىدۇ ۋە off off.بۇ يەردە يەنە قوزغىتىش تەرتىپى P. نىڭ يۇقىرى ئېقىمىدىكى كاتولىك گېنى ئاكتىپلاشتۇرغۇچى ئاقسىل- CAP باغلاش تور بېكىتى ئۈچۈن باغلىنىشلىق تور بېكەت بار.ئۈچ خىل ئېنزىمنىڭ كودلاش گېنى ئوخشاش نازارەت قىلىپ باشقۇرۇش رايونى تەرىپىدىن تەڭشەلگەن بولۇپ ، گېن مەھسۇلاتلىرىنىڭ ماس ھالدا ئىپادىلىنىشىنى ئەمەلگە ئاشۇرىدۇ.

لاكتوزا بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا ، لاك ئوپېراتسىيىسى (مېتا) باستۇرۇش ھالىتىدە تۇرماقتا.بۇ ۋاقىتتا ، PI تەشۋىقات تەرتىپىنىڭ كونتروللۇقىدىكى I تەرتىپى ئارقىلىق ئىپادىلەنگەن لاك بېسىش ماشىنىسى O تەرتىپى بىلەن باغلىنىدۇ ، بۇ RNA پولىمېراسىنىڭ P تەرتىپىگە باغلىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ ۋە ترانسكرىپسىيەنىڭ باشلىنىشىنى چەكلەيدۇ.لاكتوزا بولغاندا ، لاك ئوپېراتسىيىسى (مېتا) قوزغىلىدۇ بۇ ئوپېرون (مېتا) سىستېمىسىدا ، ھەقىقىي ئىندۇكتور لاكتوزا ئەمەس.لاكتوزا ھۈجەيرىگە كىرىدۇ ۋە β- گالاكتوسىدىزا ئارقىلىق كاتالىزاتورلۇق قىلىپ ئالولاكتوزاغا ئايلىنىدۇ.كېيىنكىسى ، ئىندۇكسىيە مولېكۇلاسى بولۇش سۈپىتى بىلەن ، بېسىملىق ئاقسىل بىلەن باغلىنىپ ، ئاقسىلنىڭ ئۆزگىرىشىنى ئۆزگەرتىدۇ ، بۇ بېسىملىق ئاقسىلنىڭ O تەرتىپى ۋە ترانسكرىپسىيەسىدىن ئايرىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.Isopropylthiogalactoside (IPTG) ئالولاكتوزا بىلەن ئوخشاش ئۈنۈمگە ئىگە.ئۇ ئىنتايىن كۈچلۈك ئىندۇكسىيە بولۇپ ، باكتېرىيە تەرىپىدىن ماددا ئالمىشىپ كەتمەيدۇ ھەمدە ناھايىتى مۇقىم بولىدۇ ، شۇڭا ئۇ تەجرىبىخانىلاردا كەڭ كۆلەمدە ئىشلىتىلىدۇ.

IPTG نىڭ ئەڭ ياخشى قويۇقلۇقىنى قانداق بېكىتىش كېرەك؟E. coli نى مىسالغا ئالايلى.
E. coli BL21 مۇسبەت قايتا ھاسىل بولىدىغان pGEX (CGRP / msCT) بولغان گېن ئارقىلىق ياسالغان بېسىم 50 mg · mL-1 Amp بولغان LB سۇيۇقلۇققا ئوكۇل قىلىنغان ۋە بىر كېچە ° C 37 قا يېتىدىكەن.يۇقارقى مەدەنىيەت 10 بوتۇلكا 50mL لىق يېڭى LB سۇيۇق ھالەتتىكى 50μg · mL-1 Amp نى كېڭەيتىش مەدەنىيىتى ئۈچۈن 1: 100 نىسبەتتە ئوكۇل قىلىندى ، OD600 قىممىتى 0.6 ~ 0.8 بولغاندا ، IPTG ئاخىرقى قويۇقلۇقىغا قوشۇلدى.ئۇ 0.1 ، 0.2 ، 0.3 ، 0.4 ، 0.5 ، 0.6 ، 0.7 ، 0.8 ، 0.9 ، 1.0mmol·L-1.ئوخشاش تېمپېراتۇرىدا ۋە ئوخشاش ۋاقىتتا كىرگۈزۈلگەندىن كېيىن ، ئۇنىڭدىن 1 مىللىلېتىر باكتېرىيە ئېرىتمىسى ئېلىنغان ، باكتېرىيە ھۈجەيرىلىرى مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق يىغىۋېلىنىپ ، SDS-PAGE نىڭ تەسىرىگە ئۇچرىغان بولۇپ ، ئوخشىمىغان IPTG قويۇقلۇقىنىڭ ئاقسىلنىڭ ئىپادىلىنىشىگە بولغان تەسىرىنى تەھلىل قىلغان. ئەڭ چوڭ ئاقسىل ئىپادىسى بىلەن IPTG قويۇقلۇقىنى تاللاڭ.
سىناقلاردىن كېيىن ، IPTG نىڭ قويۇقلۇقىنىڭ ئىمكانقەدەر چوڭ ئەمەسلىكى بايقالغان.چۈنكى IPTG نىڭ باكتېرىيەگە نىسبەتەن مەلۇم زەھىرى بار.قويۇقلۇقى ئېشىپ كەتسە ھۈجەيرىنى ئۆلتۈرىدۇ.ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، بىز ھۈجەيرىدە ئېرىيدىغان ئاقسىل قانچە كۆپ بولسا شۇنچە ياخشى بولۇشىنى ئۈمىد قىلىمىز ، ئەمما نۇرغۇن ئەھۋاللاردا IPTG نىڭ قويۇقلۇقى بەك يۇقىرى بولۇپ كەتسە ، زور مىقداردا ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.بەدەن ، ئەمما ئېرىشچان ئاقسىلنىڭ مىقدارى ئازايدى.شۇڭلاشقا ، ئەڭ ماس كېلىدىغان IPTG قويۇقلۇقى ھەمىشە قانچە چوڭ بولسا شۇنچە ياخشى بولمايدۇ ، ئەمما قويۇقلۇقى شۇنچە تۆۋەن بولىدۇ.
گېنى ئىنژېنېرلىق ماددىلارنى كىرگۈزۈش ۋە يېتىشتۈرۈشتىكى مەقسەت نىشانلىق ئاقسىلنىڭ مەھسۇلات مىقدارىنى ئاشۇرۇش ۋە تەننەرخنى تۆۋەنلىتىش.نىشان گېنىنىڭ ئىپادىلىنىشى بېسىمنىڭ ئۆزىنىڭ ئامىلى ۋە ئىپادىلەش پلازمىسىغا تەسىر كۆرسىتىپلا قالماستىن ، بەلكى باشقا تاشقى شارائىتلارغىمۇ تەسىر كۆرسىتىدۇ ، مەسىلەن ئىندۇكسىيەنىڭ قويۇقلۇقى ، كىرىش تېمپېراتۇرىسى ۋە كىرىش ۋاقتى.شۇڭلاشقا ، ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا ، نامەلۇم ئاقسىل ئىپادىلىنىش ۋە پاكلىنىشتىن ئىلگىرى ، مۇۋاپىق شارائىتنى تاللاش ۋە ئەڭ ياخشى تەجرىبە نەتىجىسىنى قولغا كەلتۈرۈش ئۈچۈن ، ئەڭ ياخشىسى كىرىش ۋاقتى ، تېمپېراتۇرا ۋە IPTG قويۇقلۇقىنى تەتقىق قىلىش كېرەك.